Penggunaan jamu sebagai obat tradisional masih tinggi di Indonesia, termasuk untuk pengobatan asam urat. Namun, praktik penambahan Bahan Kimia Obat (BKO) seperti natrium diklofenak oleh produsen tidak bertanggung jawab sering terjadi untuk memberikan efek terapi cepat, yang berpotensi membahayakan kesehatan. Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi dan menetapkan kadar natrium diklofenak dalam jamu asam urat yang beredar di Kota Madiun menggunakan metode High Performance Liquid Chromatography (HPLC) yang tervalidasi. Penelitian eksperimental laboratorium ini menggunakan uji kualitatif Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan uji kuantitatif HPLC. Validasi metode dilakukan berdasarkan parameter selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, limit of detection (LOD), dan limit of quantitation (LOQ). Sebanyak 15 sampel jamu asam urat diperoleh secara purposive sampling dari berbagai sarana distribusi di Kota Madiun. Hasil KLT menunjukkan 6 sampel (40%) positif mengandung natrium diklofenak dengan nilai Rf 0,39–0,50 yang mendekati standar (0,44–0,50). Metode HPLC memenuhi seluruh parameter validasi dengan koefisien korelasi (r) 0,996, %recovery 94-105%, %RSD 0,11-1,98%, LOD 2,3 µg/mL, dan LOQ 7,67 µg/mL. Kadar natrium diklofenak dalam sampel bervariasi antara 134,16–459,73 mg/L, dengan kadar tertinggi pada sampel L (459,73 mg/L) dan terendah pada sampel D (134,16 mg/L). Analisis statistik Kruskal-Wallis menunjukkan perbedaan kadar yang signifikan antar sampel (p=0,016). Disimpulkan bahwa metode HPLC yang digunakan valid dan seluruh sampel jamu asam urat yang terdeteksi positif mengandung BKO natrium diklofenak dengan kadar yang bervariasi dan berpotensi menimbulkan risiko kesehatan, sehingga diperlukan pengawasan yang lebih ketat dari otoritas kesehatan.